O raltitrexato é um análogo do folato que pertence à família dos anti-metabólitos e possui uma potente atividade inibitória contra a enzima timidilato sintase (TS). Comparado a outros anti-metabólitos, tais como 5-fluorouracil ou metotrexato, o raltitrexato age como um inibidor direto e específico da TS. A TS é uma enzima básica na síntese de novo do trifosfato de timidina (TTP), um nucleotídio necessário exclusivamente para a síntese do ácido desoxirribonucléico (DNA). A inibição da TS resulta na fragmentação do DNA e em morte celular. O raltitrexato é levado para dentro das células através de um transportador de folato reduzido. Em seguida, é poliglutamatado extensivamente pela enzima folilpoliglutamato sintetase (FPGS) à formas de poliglutamato que são retidas nas células e são inibidores ainda mais potentes da TS. A poliglutamação do raltitrexato aumenta a potência inibitória sobre a TS e a duração da inibição de TS nas células, as quais podem melhorar a atividade antitumoral. A poliglutamação também pode contribuir para aumentar a toxicidade, em virtude da retenção da droga nos tecidos normais.