A anfotericina B apresenta in vitro uma atividade elevada contra numerosas espécies de fungos.
Concentrações de anfotericina B variando de 0,03 a 1,0 mcg/mL inibem, in vitro, espécies tais como: Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, espécies de Candida spp, Blastomyces dermatitidis, Rhodotorula, Cryptococcus neoformans, Sporothrix schenckii, Mucor mucedo e Aspergillus fumigatus. Foram relatados outros organismos sensíveis a anfotericina B tais como Prototheca ssp, Leishmania e Naegleria. Algumas cepas resistentes de Cândida foram isoladas em pacientes imunocomprometidos recebendo tratamentos longos com anfotericina B. Técnicas padrões para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI) não foram estabelecidas para os agentes antifúngicos, e valores são variáveis dependendo dos métodos empregados. A anfotericina B não é eficaz sobre bactérias, rickettsias e vírus.