Gram-negativos: A amicacina é ativa in vitro contra Pseudomonas sp., Escherichia coli, Proteus sp. (indol-positivo e indol-negativo), Providencia sp., Klebsiella-Enterobacter- Serratia sp., Acinetobacter sp. (anteriormente Mima-Herellea) e Citrobacter freundii. Muitas cepas destas bactérias resistentes a outros aminoglicosídeos, incluindo gentamicina, tobramicina e canamicina, são sensíveis à amicacina in vitro. Estudos in vitro demonstraram que sulfato de amicacina, associado a um antibiótico betalactâmico, age sinergicamente contra vários organismos Gram-negativos de significado clínico. Ocorre supressão persistente do crescimento bacteriano de muitos organismos Gram-negativos após exposição in vitro ao sulfato de amicacina (efeito pós-antibiótico). A amicacina é resistente à degradação pela maioria das enzimas inativadoras de aminoglicosídeos que afetam a gentamicina, tobramicina e canamicina. Gram-positivos: A amicacina é ativa in vitro contra estafilococos produtores ou não de penicilinase, inclusive cepas resistentes à meticilina. Todavia, os aminoglicosídeos de modo geral tem apresentado menor atividade contra outras bactérias Gram-positivas, a saber: Streptococcus pyogenes, enterococos e Streptococcus pneumoniae.