A mitomicina inibe seletivamente a síntese do ácido desoxirribonucléico (DNA). Com concentrações elevadas da droga, as sínteses do RNA celular e de proteínas também são inibidas. A mitomicina é rapidamente eliminada do soro, após administração intravenosa. A mitomicina é amplamente distribuída, mas não parece atravessar a barreira hematoencefálica. Após injeção intravenosa de 30, 20 ou 10 mg de mitomicina, os picos de concentração sérica foram de 2,4, 1,7 e 0,52 μg/ml, respectivamente. A meia-vida sérica após injeção de 30 mg em "bôlus" é de 17 minutos. Seu "clearance" faz se principalmente por metabolismo no fígado, porém este também se processa em outros tecidos. Segundo se acredita, a taxa de "clearance" é inversamente proporcional ao pico de concentração sérica, em virtude da saturação das vias de degradação. Aproximadamente 10% da dose de mitomicina é excretada inalterada na urina. Como as vias metabólicas são saturadas com doses relativamente baixas, o percentual da dose excretada na urina aumenta com a elevação da dose administrada. Em crianças, a excreção de mitomicina administrada por via intravenosa dá-se de forma semelhante. A mitomicina não é apreciavelmente absorvida a partir da bexiga após administração intravesical.