A ampicilina é um agente bactericida por inibição da síntese da parede celular da bactéria. Sua ação é dependente da habilidade de alcançar e se ligar à proteínas específicas da membrana citoplasmática que possuem afinidade por penicilinas.
Essas proteínas, as PBPs (penicillin-binding proteins) são enzimas envolvidas no estágio final de formação da parede celular bacteriana e na formação da parede celular durante a divisão e o crescimento bacteriano. Após a ligação com a membrana citoplasmática, a ampicilina inibe a septação e a síntese da parede celular, provavelmente por acetilação das transpeptidases da membrana, impedindo a ligação cruzada das cadeias de peptidoglicano, necessárias para a rigidez da parede bacteriana, resultando numa fragilidade da parede celular bacteriana e lise. Bactérias com rápida divisão celular são as mais sensíveis à ação das penicilinas.